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無核和香味是葡萄果實的重要品質特性，也是深受消費者歡迎的性狀。目前，市場上無核且具有香味的葡萄品種較缺乏，培育香味無核的新品種是當前葡萄育種的重要目標之一。作為無核葡萄育種最有效的方法，胚挽救技術可將雜交后代的無核率提高到82%，育種周期比常規雜交育種至少縮短5年，因此，該技術得到越來越多的應用。迄今為止，國內外研究者通過胚挽救技術已經培育出一批無核葡萄新品種。然而，胚挽救的成功受許多因素的影響，包括親本基因型、取樣時期、培養基以及花前施用激素等，其中親本基因型占主導地位。敗育時胚發育程度較高的品種、胚較大的品種更適合作胚挽救的母本，父本基因型對胚珠數量和取樣時間也會產生一定影響。

本研究以4個種子敗育型葡萄品種紅寶石無核（RS）、愛神玫瑰（AS）、火州紫玉（HZ）和無核翠寶（WH）為母本，分別與玫瑰香型葡萄品種巨玫瑰（JM）、愛神玫瑰、陽光玫瑰（SM）和玫瑰香（MH）雜交，通過胚挽救技術創制一批玫瑰香型無核葡萄新種質，同時比較不同親本對胚挽救效果的影響，并利用無核基因分子標記VviAGL11-KASP和玫瑰香型基因分子標記VviDXS-KASP輔助選擇雜交后代，為進一步選育玫瑰香型無核葡萄新品種奠定基礎。

試驗于2023年在河南現代農業研究開發基地葡萄試驗園和河南省農業科學院園藝研究所進行。用于雜交的7個親本均為10年生以上成齡樹，采用簡易避雨栽培，株行距1.5m×3m，南北行向，高寬垂架式，T形整形，常規管理。供試親本特性如表1所示。

春季，父本植株花序約5%小花開放時，采集飽滿花穗，先剔除已開放的小花，然后在潔凈硫酸紙上剝離花冠，取出花藥，放在燈管下晾曬至花粉散出，過篩后收集到10mL離心管中，封口，并置于盛有無水CaCl2的密閉容器中，保存于4°C冰箱備用。花前3～4d，用指尖小心去除母本的花冠及雄蕊，避免傷到柱頭，用蒸餾水沖洗2遍花穗以達到保濕和去除殘留花粉的目的，去雄后即刻套袋。去雄后2～3d，當柱頭上出現粘液時，于上午7:00—9:00進行授粉，授粉完成即刻套袋，并標識雜交組合和授粉日期。去雄授粉期間手及所有器具用75%酒精消毒，避免花粉污染。

4個母本品種RS、AS、HZ、WH取樣時期分別為花后61d、45d、50d、36d，其中HZ的取樣時期在轉色期。

幼果用流水沖洗干凈后，放入超凈工作臺中。先用75%酒精消毒30s，再用無菌水漂洗2～3次，然后用2%NaClO消毒20min，最后用無菌水漂洗2～3次。將消毒后的幼果放在無菌培養皿中剝取胚珠，挑選長度在2mm以上的胚珠接種于ER固體培養基，每瓶接種15個胚珠，在25±1℃的培養室內暗培養。培養基的制作參照Zhu等的方法：采用容量為200mL培養瓶，每個瓶中加入40mL固體ER培養基，附加成分包括0.5g·L^-1水解酪蛋白、1.0mmol·L^-1絲氨酸、1.0mg·L^-1IAA、0.5 mg·L^-16-BA、0.5mg·L^-1GA3、60.0g·L^-1蔗糖和3.0g·L^-1活性炭、7.0g·L^-1瓊脂，pH為5.8，121℃高壓蒸汽滅菌25min。

胚珠在黑暗條件下培養8～9周后，超凈工作臺中切開胚珠，取出亮白色胚（圖1E）進行胚萌發培養。胚萌發成苗培養基為固體WPM培養基（WPM+0.2mg·L^-16BA+0.1mg·L^-1IBA+20g·L^-1蔗糖+1g·L^-1活性炭+7g·L¹瓊脂），25±2℃進行光照培養，使其萌發成苗。此期間，統計胚發育率、萌發率、成苗率。

當試管苗長至近瓶口時，進行繼代培養（? MS+0.2mg·L^-1 IBA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1瓊脂），每月繼代一次。

采用試劑盒（ND26F，諾萊梅，北京）從親本及其雜種苗幼葉中提取基因組DNA，并保存于-80 ℃。根據徐炎等（2022）的方法使用引物VviAGL11-KASP-Fa/Fb/R進行無核基因分子標記檢測，對于無法準確區分的樣品使用引物VviAGL11-400-F/R進行PCR擴增后送生工生物工程（上海）公司測序。根據王勇等（2023）方法使用引物VviDXS-KASP-Fa/Fb/R進行玫瑰香型性狀鑒定。

有關胚發育率、萌發率和成苗率的試驗數據進行3次重復，使用IBM SPSS 23.0中ANOVA單因素方差分析，顯著性分析選用鄧肯氏新復極差檢驗法（P<0.05）。

7個雜交組合共剝取胚珠5466個，發育胚935個，萌發胚607個，成苗316株，平均成苗率為5.78%。其中，組合RS×MH胚發育率最高，為26.96%；組合RS×SM的胚萌發率和成苗率最高，分別為17.42%和11.36%，上述2個組合的胚發育率、胚萌發率和成苗率之間差異不顯著。7個雜交組合中，胚發育率最低的是AS×JM，胚萌發率和成苗率最低的是WH×JM（表3）。

從表3中可以看出，RS×JM的胚發育率、萌發率、成苗率均顯著高于AS×JM和WH×JM，以JM為父本時，RS比AS和WH更適合作母本；當以AS為父本時，以RS為母本雜交的胚挽救效率顯著高于以HZ為母本的雜交組合，RS比HZ更適合作母本與AS雜交。

在同以RS為母本的雜交組合中，RS×SM和RS×MH的胚挽救效率顯著高于其他2個雜交組合，4個雜交組合的成苗率均高于5%。因此，以RS為母本時，SM、MH、JM和AS均可為父本，且SM和MH比JM和AS更適合作父本。

2.4.1 無核分子標記對雜交親本及后代的檢測

對雜交親本RS、AS、HZ和WH的檢測結果為基因型A:C，表現為無核；SM、JM和MH的檢測結果為基因型C:C，表現為有核（圖1A）。對雜交后代進行VviAGL11-KASP檢測，結果顯示RS×AS后代117個植株中有53個基因型為A:C，21個基因型為A:A，表現為無核（圖1B），對無法準確區分的3個植株，使用VviAGL11-400進行擴增后測序，結果顯示其中2個植株表現為無核（圖2），RS×AS雜交后代無核率為64.96%；RS×SM雜交后代75個植株中有21個基因型為A:C，2個基因型為A:A，表現為無核（圖1C），對無法準確區分的17個植株，測序結果顯示均表現為無核（圖2），RS×SM雜交后代無核率為53.33%；RS×MH雜交后代58個植株中有37個基因型為A:C，5個基因型為A:A，表現為無核（圖1D），對無法準確區分的2個植株，測序結果1個表現為無核（圖2），RS×MH雜交后代無核率為74.14%；RS×JM的28個雜交后代中，26個基因型為C:C，表現為有核（圖2E），對無法準確區分的2個植株，測序結果1個表現為無核（圖2），RS×JM雜交后代無核率為3.57%；AS×JM的27個雜交后代中，2個基因型為A:C，表現為無核（圖1F），對無法準確區分的5個植株，測序結果均表現為無核（圖2），AS×JM雜交后代無核率為25.93%；HZ×AS的10個雜交后代中，5個基因型為A:A，表現為無核（圖1G），對無法準確區分的3個植株，測序結果均表現為無核（圖2），HZ×AS雜交后代無核率為80.00%；WH×JM的1個雜交后代檢測結果基因型為A:C，表現為無核（圖1H）。綜上，7個雜交組合的316個后代中檢測出176個無核植株，平均無核率為55.70%。

2.4.2 玫瑰香型分子標記對雜交后代的檢測

對雜交親本WH、AS、SM、JM、MH的檢測結果為基因型G:T，表現為玫瑰香型；RS和HZ的檢測結果為基因型G:G，表現為無香型（圖3A）。對雜交后代進行VviAGL11-KASP檢測，結果顯示，RS×AS后代117個植株中檢測出42個植株基因型為G:T，11個植株的基因型為T:T（圖3B），表現為玫瑰香型，RS×AS獲得玫瑰香型雜交后代的比率為45.30%；RS×SM雜交后代中，75個植株中有7個基因型為G:T，28個基因型為T:T（圖3C），表現為玫瑰香型，RS×SM獲得玫瑰香型雜交后代的比率為46.67%；RS×MH雜交后代58個植株中有39個基因型為G:T，12個基因型為T:T（圖3D），表現為玫瑰香型，RS×MH獲得玫瑰香型雜交后代的比率為87.93%；RS×JM雜交后代中，28個植株中有11個基因型為G:T，6個基因型為T:T（圖3E），表現為玫瑰香型，RS×JM獲得玫瑰香型雜交后代的比率為60.71%；AS×JM雜交后代27個植株中有3個基因型為G:T，23個基因型為T:T（圖3F），表現為玫瑰香型，AS×JM獲得玫瑰香型雜交后代的比率為96.30%；HZ×AS的10個雜交后代未檢測出玫瑰香型后代（圖3G）；WH×JM的1個雜交后代基因型為T:T（圖3H），表現為玫瑰香型。綜上，7個雜交組合的316個后代中檢測出183個玫瑰香型植株，獲得玫瑰香型后代的比率為57.91%。

經檢測，組合RS×AS有36個雜交后代同時具有無核和玫瑰香型基因標記，RS×MH有39個，RS×SM有27個，AS×JM有7個，WH×JM有1個。316個雜交后代中同時具有無核及玫瑰香型標記的植株有110個，占比為34.81%。

合子胚的形成能力和發育進程受親本基因型的嚴格控制，母本基因型顯著影響胚挽救效果。此外，胚挽救的效率還與母本成熟期有關，早熟品種胚發生敗育較早，發育程度低，不適宜用作胚挽救母本，晚熟品種胚挽救成功率較高。近年來，學者多以胚挽救的成苗率來評價種子敗育型品種的可挽救性，胚挽救成苗率低于5%的葡萄品種不適合作母本。本研究中，以晚熟品種RS為母本的4個雜交組合成苗率均高于5%，因此，RS比較適宜作胚挽救母本，與前人研究結果一致。以早熟品種AS和WH作母本的雜交組合成苗率低于5%，不適宜作胚挽救母本，晚熟品種HZ由于胚珠較小，可挽救性也很差。同以RS為母本的4個雜交組合由于父本不同，胚發育率、萌發率與成苗率也有顯著差異，表明父本基因型也會對胚挽救效果產生一定的影響，這可能是因為父本會通過影響胚的發育進程而影響發育胚的數量，從而影響到胚挽救的效率。

無核性狀遺傳較為復雜，其規律尚未完全揭示。本研究選用VviAGL11-KASP對7個雜交組合后代進行檢測。其中RS×AS后代無核率為64.96%，HZ×AS后代的無核率為80.00%，與Ramming的結果無核×無核后代無核率45%～85%相符合；而5個無核×有核雜交組合后代的無核率介于3.57%～100%。推測雜交后代無核率差異大的原因是3個組合RS×JMAS×JMWH×JM是二倍體與四倍體雜交，染色體不配對，存在雜交不親和問題導致后代樣本量較小，存在實驗誤差。

研究表明，葡萄的玫瑰香氣與單萜類化合物的存在有關，主要包括香葉醇、里那醇、橙花醇、香茅醇、α-松油醇等。有研究者對鮮食葡萄果實單萜合成關鍵基因進行eQTL定位及候選基因挖掘，共檢測到37個與單萜合成途徑基因表達相關的eQTL。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）是調節葡萄果實中單萜類物質合成的主要調節因子。王勇等（2023）參照葡萄DXS位點信息合成KASP標記引物序列，對27個品種資源果實萜類物質調控基因DXS位點基因型進行檢測，發現該標記對葡萄香型物質調控位點的基因型檢測具有較高準確性。本研究中，AS×JM后代經檢測玫瑰香型比率達96.30%，顯著高于以RS為母本的雜交組合，表明葡萄果實香味遺傳傾向趨向親本，雙親均具有玫瑰香味的雜交組合比單親具有玫瑰香味的雜交組合更易獲得玫瑰香味的后代。在以‘紅寶石無核’為母本的4個雜交組合中，RS×MH獲得玫瑰香型后代的比率顯著高于以JMAS和SM為父本的雜交組合。因此，同樣的母本條件下，選擇MH作父本更易獲得玫瑰香型后代。

綜上，親本基因型對胚挽救效果有顯著的影響，以母本影響更大。RS較適合作為無核葡萄胚挽救的母本，SM和MH比JM和AS更適合作父本與RS雜交。通過胚挽救共獲得316個新種質，其中176個具有無核標記，183個具有玫瑰香型標記，同時具有無核和玫瑰香型標記的有110個，占比為34.81%。選擇雙親均無核或具有玫瑰香味的雜交組合更易獲得玫瑰香型無核葡萄后代。